文|經(jīng)緯創(chuàng)投
人腦是人體最精密最復(fù)雜的器官。人類的大腦有860億個(gè)神經(jīng)元,而每個(gè)神經(jīng)元平均與7000個(gè)神經(jīng)突觸連接。如此算來,大腦大概有600萬億神經(jīng)突觸連接。想要繪制一幅大腦的3D全景圖,難度不亞于精準(zhǔn)畫出銀河系中的所有星星。
但是,無論是科學(xué)家還是醫(yī)生,想要理解人腦功能、腦損傷病因和腦疾病影響都需要詳細(xì)繪制腦細(xì)胞的解剖和分子結(jié)構(gòu)及其全腦連接圖譜,但目前缺乏能捕獲細(xì)胞多尺度、多組學(xué)特性及其全腦連接的技術(shù),一直是業(yè)界需要攻克的難題。
不久前,這個(gè)諸多神經(jīng)科學(xué)家夢(mèng)寐以求的全景圖終于來了?!禨cience》雜志發(fā)表了一項(xiàng)研究,美國(guó)麻省理工學(xué)院科研團(tuán)隊(duì)公布了一個(gè)完全集成的可擴(kuò)展技術(shù)平臺(tái),通過同時(shí)繪制來自同一個(gè)完整人腦的細(xì)胞的全腦結(jié)構(gòu)和高維特征,包括空間、分子、形態(tài)、微環(huán)境、納米和連接信息等特征,最后以亞細(xì)胞分辨率,對(duì)兩個(gè)捐贈(zèng)者(一個(gè)患有阿爾茨海默病,另一個(gè)沒有)的大腦半球,實(shí)現(xiàn)了完整三維細(xì)胞成像。
什么是亞細(xì)胞分辨率?亞細(xì)胞是比細(xì)胞結(jié)構(gòu)更細(xì)化的結(jié)構(gòu),一般是電子顯微鏡(EMs)下才可見的細(xì)胞結(jié)構(gòu)如線粒體,中心體,高爾基體,細(xì)胞壁上的紋孔等。亞細(xì)胞分辨率意味著,這個(gè)平臺(tái)的分辨率已經(jīng)精確到可以看清大腦中的單個(gè)突觸。
點(diǎn)看一張大腦全景圖,人體中最復(fù)雜的事物仿佛變成了一個(gè)璀璨星河。這篇文章將深入拆解繪制高精度“大腦地圖”具體分幾步?除了麻省理工團(tuán)隊(duì),谷歌震撼發(fā)布的納米級(jí)人腦圖譜,將如何加速人類大腦研究進(jìn)度?對(duì)人類大腦重建的研究,有何意義?以下,Enjoy:
1 切片、處理、成像,人腦繪圖三步走
要深入了解一顆完整的人腦,并清楚知道其復(fù)雜有序的內(nèi)部結(jié)構(gòu)是件十分困難的事情。為此,麻省理工學(xué)院的研究團(tuán)隊(duì)開發(fā)了一種整合平臺(tái),能夠同時(shí)獲取人腦細(xì)胞的空間、分子、形態(tài)和連接信息。這項(xiàng)技術(shù)包括三個(gè)核心部分:高精度切片的振動(dòng)切片機(jī)(MEGAtome)、用于多重多尺度成像的高分子水凝膠組織處理技術(shù)(mELAST)和三維連接性重建的計(jì)算管道(UNSLICE)。
平臺(tái)的工作流程包括切片、處理、標(biāo)記、成像和計(jì)算拼接人類大腦組織。在磁共振(MR)成像之后,使用MEGAtome將人腦半球切成毫米厚的塊。這些塊經(jīng)過處理并轉(zhuǎn)化為mELAST組織水凝膠。堅(jiān)韌、彈性且可調(diào)節(jié)大小的mELAST組織水凝膠,經(jīng)過多輪標(biāo)記和多尺度成像,以提取高維特征。從切割的人腦組織獲得的圖像使用UNSLICE管道進(jìn)行計(jì)算性重整,以實(shí)現(xiàn)多級(jí)連接映射。
1. MEGAtome:高精度切片技術(shù)
MEGAtome是一種將完整的人腦半球切成細(xì)致的裝置,不會(huì)對(duì)其造成任何損害。
傳統(tǒng)的振動(dòng)切片機(jī)(如徠卡VT1200)僅限于小樣本,并且經(jīng)常導(dǎo)致組織損傷。此外,由于其刀片振動(dòng)速度有限和較大的刀片面外振動(dòng),切割表面常常遭受磨損、撕裂和變形。
為了解決這些限制,麻省理工學(xué)院的研究團(tuán)隊(duì)開發(fā)了一種高度通用的振動(dòng)刀——MEGAtome(機(jī)械增強(qiáng)的大尺寸無磨損振動(dòng)刀)。它能夠?qū)Ω鞣N生物樣本進(jìn)行超精密切片,從小器官到完整的人類大腦半球和大型動(dòng)物器官陣列。同時(shí),MEGAtome能夠?qū)崿F(xiàn)高頻刀片振動(dòng),振幅增加,面外振動(dòng)位移低,而這些均得益于多自由度(multi - degree of)系統(tǒng)對(duì)刀片振動(dòng)控制的優(yōu)化。
為了最小化平面外寄生葉片振動(dòng),研究人員采用柔性系列設(shè)計(jì)增加了系統(tǒng)的平面外剛度。實(shí)驗(yàn)過程中,研究人員通過切片大的人小腦組織(36 mm x 45 mm x 20 mm)并測(cè)量其表面輪廓,發(fā)現(xiàn)MEGAtome產(chǎn)生了具有出色表面均勻性的完整切片,保留了精細(xì)的組織架構(gòu)。最后,MEGAtome成功地將整個(gè)人類大腦半球切片,并在8小時(shí)內(nèi)生成40個(gè)連續(xù)的4毫米厚的板。
值得注意的是,MEGAtome不適合切片硬樣品,如骨、石蠟包埋或冷凍樣品,因?yàn)樗鼈兊母邩悠纷枇?huì)破壞刀片振動(dòng)精度。
2.mELAST:高分子水凝膠組織處理
大腦完成切片后,化學(xué)團(tuán)隊(duì)開發(fā)的mELAST的組織凝膠技術(shù),可以將組織樣本轉(zhuǎn)化為水凝膠,可以使大腦切片變得堅(jiān)不可摧,讓每個(gè)切片清晰、靈活、耐用和擴(kuò)展,同時(shí)保留內(nèi)源性生物分子和細(xì)胞結(jié)構(gòu),并能夠進(jìn)行重復(fù)的標(biāo)記。
這種水凝膠是彈性的、熱化學(xué)穩(wěn)定的,并且能夠可逆地?cái)U(kuò)展。mELAST處理后的組織水凝膠能夠在水或磷酸鹽緩沖液(PBS)中實(shí)現(xiàn)線性擴(kuò)展,論文中提到實(shí)現(xiàn)了4.5倍的線性擴(kuò)展,同時(shí)保持組織的彈性、完整性和耐久性。
同時(shí),實(shí)驗(yàn)過程中,mELAST成功地保留了蛋白質(zhì)表位,并且在周期性壓縮或組織膨脹期間沒有結(jié)構(gòu)或分子信息丟失。此外,mELAST技術(shù)還允許使用單一實(shí)驗(yàn)步驟對(duì)厚組織進(jìn)行多輪染色,每次染色和成像后,組織可以完全去除抗體并重新染色,這使得使用相同條件對(duì)不同抗體進(jìn)行統(tǒng)一染色成為可能,無需額外優(yōu)化。
因此,mELAST處理后的組織可以進(jìn)行多尺度成像,從宏觀到微觀層面捕獲不同的生物學(xué)信息。這包括大腦的廣泛結(jié)構(gòu)、細(xì)胞和亞細(xì)胞特征。這對(duì)于深入理解組織結(jié)構(gòu)和功能,尤其是在神經(jīng)科學(xué)和疾病研究領(lǐng)域,具有重要意義。
3.UNSLICE:三維連接性重建
在對(duì)每塊板進(jìn)行成像后,剩下的任務(wù)是通過計(jì)算恢復(fù)整個(gè)腦半球的完整圖像。
當(dāng)前的計(jì)算重建方法通常適用于薄的、未變形的或側(cè)向小的組織切片,不適用于大型的、經(jīng)過大量處理的人腦平板級(jí)圖像。大型哺乳動(dòng)物組織的其他方法還沒有實(shí)現(xiàn)以單纖維分辨率精確重建人腦組織中密集免疫標(biāo)記的神經(jīng)突起。
為了實(shí)現(xiàn)厚組織體積的精確多尺度重建,研究人員開發(fā)了一個(gè)名為UNSLICE的計(jì)算管道,即通過相互連接的切割纖維端點(diǎn),鏈接統(tǒng)一相鄰的切片組織,它在宏觀、中觀(血管)和微尺度(軸突)水平上準(zhǔn)確地對(duì)齊解剖特征。
用于2D圖像配準(zhǔn)是基于強(qiáng)度或特征的配準(zhǔn)方法,但該實(shí)驗(yàn)中的厚組織因變形而無法擴(kuò)展到大、厚和高度加工組織的板間配準(zhǔn),則需要更相關(guān)和可靠的特征。為此,UNSLICE利用脈管系統(tǒng)的熒光標(biāo)記來匹配切割表面的血管端點(diǎn),以定義平滑的變形場(chǎng)。
在中間或“中層”尺度上,UNSLICE通過算法追蹤從相鄰層進(jìn)入一層的血管并匹配它們。但它也需要一種更精細(xì)的方法。為了進(jìn)一步記錄這些板,研究小組特意用不同的顏色標(biāo)記了相鄰的神經(jīng)軸突(如電氣裝置中的電線),這使得UNSLICE能夠根據(jù)追蹤軸突來匹配各層。
通過以迭代和并行化的方式結(jié)合手動(dòng)操作的方式,將變形初始化的對(duì)應(yīng)關(guān)系以及自動(dòng)化的血管端點(diǎn)進(jìn)行匹配,用戶可以靈活選擇精度水平。UNSLICE的成功應(yīng)用展示了管線在大規(guī)模人體器官組織的蛋白質(zhì)組學(xué)和項(xiàng)目組學(xué)分析方面的可擴(kuò)展性。
通過上述的MEGAtome的振動(dòng)式切片機(jī)、mELAST的組織凝膠技術(shù)、UNSLICE計(jì)算管道實(shí)現(xiàn)了對(duì)腦組織切片、處理和成像,最終可以對(duì)人類大腦半球進(jìn)行完整成像,分辨率甚至精細(xì)到單個(gè)突觸。
更為驚人的是,該平臺(tái)想要完成腦半球成像只需100小時(shí),速度遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過以往的幾個(gè)月。這意味著科學(xué)家可短時(shí)間創(chuàng)建更多樣本,同時(shí)可以使用同一個(gè)大腦對(duì)問題進(jìn)行綜合探索,而不必觀察不同大腦中的不同現(xiàn)象后再構(gòu)建綜合圖像。
2 阿爾茨海默病中的人類大腦組織有何不同?
如果科學(xué)家有一張高精度的大腦地圖,是不是可以按圖索驥,攻克阿爾茨海默病、帕金森病、抑郁癥、精神分裂癥等疑難雜癥了呢?
在本次研究中,研究人員嘗試著觀察了阿爾茨海默病患者的大腦,看看究竟有何不同?麻省理工學(xué)院團(tuán)隊(duì)對(duì)比了來自兩位捐贈(zèng)者的人類大腦組織的分子和結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié):捐贈(zèng)者1是一位未癡呆的對(duì)照組(一位61歲女性),捐贈(zèng)者2患有阿爾茨海默病(AD)引起的癡呆(一位88歲女性)。
研究人員先使用MEGAtome切割兩位捐贈(zèng)者的大腦半球,并獲得了相同神經(jīng)解剖學(xué)水平的完整冠狀板。
研究中,他們對(duì)兩名捐獻(xiàn)者的大腦半球進(jìn)行了精細(xì)處理、豐富標(biāo)記和清晰成像。經(jīng)過3D細(xì)胞表型分析算法,整個(gè)樣本的細(xì)胞分析結(jié)果顯示,在對(duì)照組中有7,464,727個(gè)NeuN+細(xì)胞,在而AD(阿爾茨海默?。┚栀?zèng)者大腦有2,890,858個(gè)NeuN+細(xì)胞。與對(duì)照組相比,阿爾茨海默病中的NeuN+細(xì)胞密度降低了46.5%(13.0×10^3/mm^3對(duì)比24.3×10^3/mm^3),這一損失比以往報(bào)告(22%至40%)更為嚴(yán)重。
在對(duì)照組中,沒有觀察到NeuN+細(xì)胞密度的區(qū)域差異,而阿爾茨海默病的樣本扣帶回(cingulate gyrus, CgG)和眶回(orbital gyrus, OrG)的NeuN+細(xì)胞密度比其他腦區(qū)要低。
隨后,研究人員進(jìn)一步調(diào)查了高神經(jīng)元丟失區(qū)域的細(xì)胞和分子變化,特別是來自O(shè)rG(眶回)的眶額皮層(OFC)。OFC是一個(gè)前額皮層區(qū)域,以其在高階認(rèn)知任務(wù)中的作用而聞名,例如決策制定,在AD(阿爾茨海默?。┑耐砥?,其連接性會(huì)受到損害。
實(shí)驗(yàn)觀察發(fā)現(xiàn),AD與對(duì)照組相比,在病理相關(guān)蛋白,即淀粉樣蛋白b(Ab)和磷酸化tau(pTau),以及星形膠質(zhì)細(xì)胞(GFAP)的分布模式上有明顯差異。在AD樣本中,已知包圍pTau+神經(jīng)纖維纏結(jié)的AD老年斑塊在整個(gè)皮層區(qū)域密集分布,與對(duì)照組中主要在第三層定位且pTau+纏結(jié)很少形成鮮明對(duì)比。并且AD鄰近層星形膠質(zhì)細(xì)胞的密度較低,它們的突起只延伸到第二層和第三層的邊界。他們還觀察到,由于神經(jīng)炎癥,AD中星形膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量異常增加。
在神經(jīng)元纖維方面,AD患者的纖維取向發(fā)生了改變,主要為正交取向,且在所有皮質(zhì)層中分布相似,而對(duì)轉(zhuǎn)組有有平行、正交和斜向等多種取向;AD患者的軸突、髓鞘、突觸等發(fā)生了病變。
實(shí)驗(yàn)人員通過觀察發(fā)現(xiàn),AD患者大腦在細(xì)胞數(shù)量、細(xì)胞類型、分子分布以及神經(jīng)結(jié)構(gòu)等多方面與普通人的大腦存在明顯差異,這些差異體現(xiàn)了AD的多種病理特征。根據(jù)上述兩個(gè)樣本,該團(tuán)隊(duì)并沒有辦法給出任何關(guān)于阿爾茨海默病性質(zhì)的結(jié)論,但這項(xiàng)研究實(shí)現(xiàn)了一大突破,人類現(xiàn)在有能力對(duì)整個(gè)人腦半球進(jìn)行全面成像和深入分析。
該研究目前尚未呈現(xiàn)出全部大腦的圖譜,但他們?yōu)榭茖W(xué)家提供了一個(gè)途徑,去了解大腦每個(gè)細(xì)胞的獨(dú)有特性和細(xì)胞外分子之間的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)簇。這為大腦宇宙研究提供了更先進(jìn)的工具和思路,更有望開啟腦科學(xué)研究的盛宴。
值得一提的是,該技術(shù)不僅適用于大腦,還適用于身體其他組織,這將極大促進(jìn)科學(xué)家對(duì)人體器官功能和疾病機(jī)制的理解。
3 人腦研究進(jìn)入納米級(jí)時(shí)代
人類進(jìn)入無人之境離不開導(dǎo)航,科學(xué)家想探訪科學(xué)領(lǐng)域的無人區(qū)“人腦”自然也需要“地圖”。
為了繪制完整的人類大腦圖譜,自2013 年開始,美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院開啟了“美國(guó)腦計(jì)劃”項(xiàng)目——大腦細(xì)胞普查網(wǎng)絡(luò)聯(lián)盟(Brain Research through Advancing Innovative Neurotechnologies Initiative-Cell Census Network,BICCN),旨在用前沿技術(shù)對(duì)小鼠、非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物和人類大腦的細(xì)胞類型進(jìn)行識(shí)別和分類,并針對(duì)特定細(xì)胞類型開發(fā)新的遺傳工具。
2023 年,BICCN 的合作單位在 Science 及其子刊齊發(fā) 21 篇論文,報(bào)道了該計(jì)劃中人類大腦相關(guān)的首部分結(jié)果?!犊茖W(xué)》雜志高級(jí)編輯Mattia Maroso當(dāng)時(shí)曾這樣評(píng)論:“人腦研究的細(xì)胞時(shí)代正在叩響我們的大門!"
這計(jì)劃是為神經(jīng)生物學(xué)領(lǐng)域提供“大腦地圖”,最終到指導(dǎo)治療人類腦疾病。那么,地圖自然越精準(zhǔn)越好。就在麻省理工發(fā)布上述研究的前一個(gè)月,谷歌團(tuán)隊(duì)聯(lián)手哈佛在AI的加持下,發(fā)布了納米級(jí)人腦圖譜,也登上了Science。
該實(shí)驗(yàn)從一位45歲女性癲癇患者的顳葉皮層提取了組織樣本,大小約為1立方毫米。經(jīng)過切片、顯微成像得到了總大小約1.4PB的原始二維圖像數(shù)據(jù)。接下來,研究者使用計(jì)算工具對(duì)這些二維圖像進(jìn)行了拼接、對(duì)齊,并重建出三維的體素?cái)?shù)據(jù)。
他們重建了數(shù)千個(gè)神經(jīng)元,超過一億個(gè)突觸連接,以及構(gòu)成人類大腦物質(zhì)的所有其他組織元素,包括膠質(zhì)細(xì)胞、血管和髓磷脂。同時(shí),他們還使用機(jī)器學(xué)習(xí)模型對(duì)突觸位置進(jìn)行自動(dòng)識(shí)別,以及區(qū)分興奮性、抑制性突觸。
最終,團(tuán)隊(duì)成功在納米級(jí)別建模出了1立方毫米的腦組織,包含5萬多個(gè)細(xì)胞核1.5億突觸,以及其間230毫米的超細(xì)靜脈,生動(dòng)展示了一塊大約半米粒大小的人類顳葉皮層中的每個(gè)細(xì)胞及其神經(jīng)連接網(wǎng)絡(luò)。
因此,他們得到了有史以來分辨率最高、數(shù)據(jù)量最大的關(guān)于人腦結(jié)構(gòu)的數(shù)據(jù)集。該研究涉及了1立方毫米的人腦組織,產(chǎn)生的數(shù)據(jù)量卻高達(dá)1.4PB。1立方毫米體積的腦組織中包含了5.7萬細(xì)胞和1.5億突觸,而整個(gè)大腦中的突觸數(shù)量更是高達(dá)千萬億。如果算來,所有整個(gè)互聯(lián)網(wǎng)上的服務(wù)器都拿過來,只能存儲(chǔ)下9個(gè)人腦,數(shù)據(jù)量驚人。
在詳細(xì)檢查該模型時(shí),研究人員有個(gè)驚奇的發(fā)現(xiàn):軸突螺旋。其中一些神經(jīng)元彼此之間建立了多達(dá)50個(gè)連接。
此外,研究小組發(fā)現(xiàn)細(xì)胞群往往是以「鏡像對(duì)稱」的方式出現(xiàn)。但目前,研究團(tuán)隊(duì)尚不清楚這些特征在大腦中起什么作用。這些發(fā)現(xiàn)卻還是一個(gè)窗口,為讓大家看到大腦中一些前所未見的結(jié)構(gòu),可能會(huì)改變我們對(duì)大腦工作方式的理解。
每一個(gè)新發(fā)現(xiàn),都有可能成為探索“人腦”這一無人區(qū)的利器。這就是科學(xué)前進(jìn)的方向。
References:
1.science:Integrated platform for multiscale molecular imaging
and phenotyping of the human brain2.新技術(shù)平臺(tái)實(shí)現(xiàn)人腦半球完整成像 科技日?qǐng)?bào)3.以亞細(xì)胞分辨率“繪圖”——新技術(shù)平臺(tái)實(shí)現(xiàn)人腦半球完整成像 來源:北京科協(xié)