文｜動(dòng)脈新醫(yī)藥
近幾年，細(xì)胞與基因治療因其驚人的療效，被大眾寄予厚望。同樣，細(xì)胞與基因治療背后的核心底層技術(shù)——基因編輯工具，也在近年開始浮出水面，被越來越多的企業(yè)和資本重視。
2022年2月28日，美國專利和商標(biāo)局（USPTO）裁定，張鋒所在的博德研究所團(tuán)隊(duì)繼續(xù)擁有在真核細(xì)胞中使用CRISPR基因編輯工具的專利?！爸Z獎(jiǎng)（以Jennifer和Emmanuelle為代表的團(tuán)隊(duì)）團(tuán)隊(duì)”又一次輸?shù)袅诉@場(chǎng)長達(dá)近10年的知識(shí)產(chǎn)權(quán)爭(zhēng)奪。針對(duì)上述結(jié)果，Jennifer團(tuán)隊(duì)表示將會(huì)提起上訴，看來這場(chǎng)長達(dá)10年的專利角逐還遠(yuǎn)未結(jié)束。
作為醫(yī)療行業(yè)觀察者，動(dòng)脈新醫(yī)藥也在時(shí)刻關(guān)注基于CRISPR技術(shù)的新一代基因編輯工具。對(duì)此，我們采訪了國內(nèi)數(shù)家基因編輯工具開發(fā)/細(xì)胞與基因治療企業(yè)，聽聽業(yè)內(nèi)科學(xué)家們的看法。接下來，你將了解到：
1.作為目前使用最廣泛的基因編輯工具，CRISPR/Cas9是否存在技術(shù)短板？
2.基于CRISPR/Cas9的優(yōu)化，是否為錦上添花？一旦出現(xiàn)專利壟斷，此前的努力會(huì)功虧一簣嗎？
3.針對(duì)基因編輯工具技術(shù)，國內(nèi)團(tuán)隊(duì)偏向于技術(shù)優(yōu)化還是底層技術(shù)的創(chuàng)新？
4.針對(duì)近幾年較熱的CRISPR/Cas12、CRISPR/Cas13，它們的專利布局如何？國內(nèi)企業(yè)為何可以在短期內(nèi)就做出創(chuàng)新性成果？
5.為何大部分企業(yè)針對(duì)基因編輯工具的開發(fā)和優(yōu)化都十分“低調(diào)”，從不宣傳？投資機(jī)構(gòu)更看重產(chǎn)品進(jìn)展還是底層技術(shù)？
6.未來，基因編輯工具會(huì)朝著哪些趨勢(shì)開發(fā)和優(yōu)化？國內(nèi)和國外還存在多少差距？
01 脫靶、安全、編輯效率，都不是痛點(diǎn)
根據(jù)公開資料，我們可以很輕易的歸納出CRISPR/Cas9基因編輯工具本身存在以下幾個(gè)痛點(diǎn)：
1、潛在的脫靶風(fēng)險(xiǎn)（脫靶的檢測(cè)與控制）。對(duì)于潛在的脫靶風(fēng)險(xiǎn)的控制，科研團(tuán)隊(duì)在設(shè)計(jì)基因編輯工具時(shí)，可盡量避免有相似的序列，以免造成序列依賴性?；诖诉M(jìn)行嚴(yán)格的脫靶驗(yàn)證，就可最大程度避免該風(fēng)險(xiǎn)。
2、切割基因組DNA序列所導(dǎo)致的潛在安全性風(fēng)險(xiǎn)。在此過程中，如果發(fā)生了DNA雙鏈斷裂，可能會(huì)引起DNA大片段的缺失，或染色體結(jié)構(gòu)的變化。但通常情況下，大片段的缺失和染色體的異常變化都會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞不容易存活。目前，尚未報(bào)道過相關(guān)的安全事件，所以這一問題暫時(shí)還沒有影響基因編輯在產(chǎn)業(yè)端的應(yīng)用推進(jìn)。
3、對(duì)PAM序列的要求，限制了其在基因組上的可編輯范圍。在CRISPR/Cas9靶向DNA進(jìn)行編輯時(shí)，可以實(shí)現(xiàn)DNA雙鏈的斷裂。在此基礎(chǔ)上，如果再加上相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，則可以實(shí)現(xiàn)某些基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。但這些基因的靶向位點(diǎn)會(huì)受到PAM序列的限制，從而不能讓基因編輯實(shí)現(xiàn)“指哪打哪”的魔力。
4、體內(nèi)遞送系統(tǒng)的設(shè)計(jì)和搭配。CRISPR/Cas9作為一個(gè)基因編輯工具，如何跟體內(nèi)的遞送系統(tǒng)進(jìn)行有效的搭配，同時(shí)保持本身的編輯能力和成藥能力，也是一個(gè)需要不斷被優(yōu)化的點(diǎn)。目前CRISPR/Cas9分子量較大，在進(jìn)行體內(nèi)基因治療需要AAV進(jìn)行遞送時(shí)，AAV裝載量的限制，就要求基因編輯工具的尺寸進(jìn)一步微型化。
總體來說，不僅是CRISPR/Cas9，所有的CRISPR/Cas蛋白家族或多或少都有自己的優(yōu)點(diǎn)和不足。沒有任何一個(gè)CRISPR/Cas基因編輯工具可以完全覆蓋所有的應(yīng)用場(chǎng)景，如果將CRISPR/Cas9用于敲除某個(gè)基因，它已經(jīng)足夠優(yōu)秀。只要能夠做到“術(shù)業(yè)有專攻”，將基因編輯工具用于合適的領(lǐng)域，便可以讓其“發(fā)光發(fā)熱”。
02 錦上添花or功虧一簣？
國內(nèi)團(tuán)隊(duì)基于專利技術(shù)被國外壟斷的CRISPR/Cas9基因編輯工具的優(yōu)化，是否為錦上添花？一旦出現(xiàn)專利壟斷，此前的努力會(huì)功虧一簣嗎？
在討論這個(gè)問題前，我們需要縷清CRISPR/Cas9的發(fā)展之路，和伴隨發(fā)展延續(xù)至今的專利之爭(zhēng)。
2012年8月，Jennifer團(tuán)隊(duì)在《Science》合作發(fā)表了CRISPR/Cas9領(lǐng)域的里程碑論文；2013年2月，張鋒團(tuán)隊(duì)也在《Science》發(fā)表了論文，文章原始數(shù)據(jù)表明其相關(guān)實(shí)驗(yàn)早于Jennifer團(tuán)隊(duì)。2014年，美國專利商標(biāo)局率先批準(zhǔn)了張鋒團(tuán)隊(duì)所在的博德研究所的專利請(qǐng)求。在此后多次訴訟中，因Jennifer團(tuán)隊(duì)證據(jù)不足，張鋒團(tuán)隊(duì)屢占上風(fēng)，特別是最具商業(yè)價(jià)值的、用于哺乳動(dòng)物的基因編輯工具專利被張鋒團(tuán)隊(duì)牢牢攥在手中。
2020年10月，諾貝爾評(píng)獎(jiǎng)委員會(huì)公布化學(xué)獎(jiǎng)獲獎(jiǎng)名單，Jennifer和Emmanuelle獲得殊榮，原因是她們開發(fā)了基因編輯工具CRISPR/Cas9。張鋒“痛失諾獎(jiǎng)”，引發(fā)熱議。今年2月28日，美國專利和商標(biāo)局裁定，張鋒所在的博德研究所團(tuán)隊(duì)擁有在真核細(xì)胞中使用CRISPR基因編輯工具的專利。“諾獎(jiǎng)”團(tuán)隊(duì)暫時(shí)輸?shù)袅舜舜螌?duì)于知識(shí)產(chǎn)權(quán)的爭(zhēng)奪，但這場(chǎng)超過10年的專利角逐還遠(yuǎn)未結(jié)束。
對(duì)于CRISPR/Cas9的專利屬權(quán)一直爭(zhēng)議不斷，但很明確的是，CRISPR/Cas9的專利技術(shù)基本屬于國外。
“任何一種技術(shù)，在發(fā)展早期都具有待突破的瓶頸。對(duì)于技術(shù)發(fā)明人，他們也需要解決這些瓶頸，才能真正的實(shí)現(xiàn)技術(shù)在產(chǎn)業(yè)化端的成功應(yīng)用。如果國內(nèi)的團(tuán)隊(duì)基于CRISPR/Cas9技術(shù)的優(yōu)化足夠重大，以至于國外團(tuán)隊(duì)也需要用到我們的‘錦上添花’，就有可能通過專利交叉許可解決技術(shù)的專利壟斷問題?！卑钜锫?lián)合創(chuàng)始人兼副總裁李大力博士告訴動(dòng)脈新醫(yī)藥。
“一般企業(yè)在立項(xiàng)時(shí)就會(huì)考慮關(guān)鍵技術(shù)的IP屬性這一問題。我們可以看到，CRISPR/Cas9專利權(quán)人在全球范圍內(nèi)都向很多企業(yè)提供了商業(yè)化授權(quán)許可，包括技術(shù)服務(wù)和藥物開發(fā)等各個(gè)方向。企業(yè)需要向?qū)＠钟蟹街Ц妒跈?quán)費(fèi)或達(dá)成授權(quán)許可協(xié)議，便可以應(yīng)用相關(guān)技術(shù)。另一方面，CRISPR/Cas9技術(shù)也在持續(xù)創(chuàng)新和改進(jìn)，衍生的這些技術(shù)也能產(chǎn)生巨大的商業(yè)價(jià)值?！比痫L(fēng)生物創(chuàng)始人梁峻彬博士告訴動(dòng)脈新醫(yī)藥。
關(guān)于轉(zhuǎn)讓或許可技術(shù)給其他公司進(jìn)行開發(fā)，從而帶來收益，相關(guān)的例子并不缺乏。例如日本微生物組基因編輯療法公司Bio Palette從神戶大學(xué)獲得了使用nickase Cas9進(jìn)行單堿基編輯的專利的許可，做了一系列創(chuàng)新并獲得了收益，這一技術(shù)就屬于對(duì)CRISPR/Cas9技術(shù)的優(yōu)化。再例如Bio Palette與Beam公司就堿基編輯技術(shù)進(jìn)行了交叉許可（獲得Beam許可），Bio Palette因此從中獲益。
“在工業(yè)界，美國的基因編輯企業(yè)在成立之初就會(huì)優(yōu)先考慮其底層IP是否清晰。對(duì)于國內(nèi)的早期企業(yè)而言，依靠團(tuán)隊(duì)或平臺(tái)優(yōu)勢(shì)就能夠獲得資本和市場(chǎng)的認(rèn)可。隨著企業(yè)的發(fā)展，基于技術(shù)優(yōu)化的一定積累，開發(fā)原始創(chuàng)新的技術(shù)更有利于促進(jìn)企業(yè)長遠(yuǎn)和自由發(fā)展。”輝大基因創(chuàng)始人兼CEO姚璇博士告訴動(dòng)脈新醫(yī)藥。
基于業(yè)內(nèi)人士的認(rèn)知，我們不妨看得更“開”。如果一項(xiàng)技術(shù)確實(shí)具有重大的價(jià)值，那它其實(shí)很難被個(gè)別機(jī)構(gòu)所壟斷。這種壟斷只會(huì)埋沒高技術(shù)的價(jià)值，不利于其科研和商業(yè)價(jià)值的放大。不管在學(xué)術(shù)界還是產(chǎn)業(yè)界，都需要大量的持續(xù)創(chuàng)新才會(huì)使得這個(gè)技術(shù)的本身的社會(huì)價(jià)值和商業(yè)價(jià)值越來越大。
03 技術(shù)優(yōu)化or底層創(chuàng)新？
盡管國內(nèi)大多企業(yè)認(rèn)為基于CRISPR/Cas9的技術(shù)優(yōu)化并不會(huì)出現(xiàn)功虧一簣的情況。但是當(dāng)動(dòng)脈新醫(yī)藥問及企業(yè)目前偏向于基于國外專利技術(shù)進(jìn)行優(yōu)化還是自主研發(fā)實(shí)現(xiàn)底層創(chuàng)新時(shí)。企業(yè)們還是“口嫌體正直”的統(tǒng)一選擇了更為艱難的底層創(chuàng)新。
李大力博士說道：“邦耀生物做了許多堿基剪輯器的開發(fā)，并在2020年就開發(fā)了一系列超高活性的新型胞嘧啶堿基編輯器（命名為：hyCBE），相關(guān)成果已在線發(fā)表于Nature Cell Biology。至今，它仍然是活性最高的胞嘧啶堿基編輯器（最高可提升20倍活性），其編輯窗口較傳統(tǒng)編輯器也有明顯擴(kuò)增，能編輯到更多的位點(diǎn)。更重要的是，這種改造方法具有兼容性，它不僅適用于改造胞嘧啶堿基編輯器，其他堿基編輯器同樣適用于這個(gè)方法，在基因治療等領(lǐng)域已展示出非常廣闊的應(yīng)用前景。
同年6月，邦耀生物團(tuán)隊(duì)又在國際著名學(xué)術(shù)期刊Nature Biotechnology發(fā)文，開發(fā)出全新的雙堿基編輯系統(tǒng)，這項(xiàng)成果不僅是堿基編輯工具開發(fā)領(lǐng)域的又一重大突破，也為基礎(chǔ)研究和遺傳性疾病如β-地中海貧血的治療提供了新的發(fā)展方向和工具。針對(duì)上述提到的堿基編輯器，邦耀生物已申請(qǐng)了多項(xiàng)專利，并進(jìn)行了全球化布局?！?/p>
梁峻彬博士說道：“瑞風(fēng)目前針對(duì)CRISPR/Cas系列工具酶進(jìn)行了開發(fā)。在Cas13方面我們率先進(jìn)行了專利布局。瑞風(fēng)開發(fā)的新型蛋白對(duì)特定RNA靶核酸的編輯活性優(yōu)于目前最常用的高活性CasRx，且脫靶效應(yīng)更低。其中一高活性Cas13的尺寸比CasRx小約70aa，更有利于AAV遞送，在成藥上具有極大的優(yōu)越性。此外，新的Cas12亞型也是瑞風(fēng)正在開發(fā)的方向。我們還對(duì)某些Cas12蛋白進(jìn)行了工程化改造，目前也已經(jīng)取得了不錯(cuò)的成果，顯著提高了野生型參比蛋白的活性，且不受Cas12亞型專利壁壘限制?！?/p>
姚璇博士說道：“輝大科學(xué)家團(tuán)隊(duì)在2020年通過數(shù)據(jù)計(jì)算分析開發(fā)了兩類新型CRISPR/Cas13 RNA編輯系統(tǒng)，2021年在《Nature Methods》發(fā)表了相關(guān)文章，介紹了我們?nèi)绾卧诓煌臄?shù)據(jù)庫中篩選蛋白，進(jìn)而獲得高的RNA編輯器。這兩年間，我們對(duì)Cas13進(jìn)行了許多改造和優(yōu)化，得到了特異性強(qiáng)、脫靶性低的高保真版本hf-Cas13蛋白，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中已經(jīng)取得了積極的有效性和安全性試驗(yàn)數(shù)據(jù)。Cas12Max是輝大子品牌HuiEdit科學(xué)家團(tuán)隊(duì)在去年開發(fā)的新型DNA編輯器，目前經(jīng)過優(yōu)化后的Cas12蛋白在體外和體內(nèi)都能實(shí)現(xiàn)與spCas9相當(dāng)?shù)腄NA編輯效率。同時(shí)，團(tuán)隊(duì)還在繼續(xù)優(yōu)化其PAM識(shí)別區(qū)，以進(jìn)一步擴(kuò)大Cas12的靶向序列范圍。針對(duì)CRISPR/Cas12和CRISPR/Cas13，輝大均已申請(qǐng)相應(yīng)的全球?qū)＠?，并做了底層專利的布局?；谶@些成果，輝大正在積極和國內(nèi)外多家企業(yè)洽談專利許可、聯(lián)合開發(fā)等相關(guān)合作?！?/p>
為何國內(nèi)的基因編輯企業(yè)們會(huì)在近幾年頻頻爆出底層技術(shù)的創(chuàng)新？究其原因，主要有三。
其一，在CRISPR/Cas9基因編輯工具技術(shù)剛剛面世時(shí)，不管是企業(yè)還是科研機(jī)構(gòu)，都還處于了解和學(xué)習(xí)的歷程。那時(shí)候國內(nèi)的團(tuán)隊(duì)們本身對(duì)新工具的認(rèn)知還處于不斷深化和積累的狀態(tài)，只能對(duì)底層技術(shù)進(jìn)行優(yōu)化。這一階段對(duì)應(yīng)國內(nèi)的2013年至2018年，屬于CRISPR/Cas9基因編輯工具技術(shù)在國內(nèi)發(fā)展的第一個(gè)五年。
其二，在積累到足夠經(jīng)驗(yàn)時(shí)，國內(nèi)的團(tuán)隊(duì)基于此前優(yōu)化的創(chuàng)新點(diǎn)得出通用的底層邏輯，或者是開發(fā)基因編輯工具的相關(guān)經(jīng)驗(yàn)。通過技術(shù)遷移或者是技術(shù)兼容，初步探索新型基因編輯工具。該階段對(duì)應(yīng)國內(nèi)的2018年至今。
其三，縱觀整個(gè)基因編輯工具的發(fā)展歷史，我們可以發(fā)現(xiàn)人類對(duì)于自然界微生物的了解還是冰山一角。仍然有大量的編輯工具可以持續(xù)不斷的發(fā)掘。沿著高度優(yōu)化或原創(chuàng)性技術(shù)開發(fā)的方向前進(jìn)，就能一直對(duì)現(xiàn)有基因編輯工具進(jìn)行局部創(chuàng)新和迭代創(chuàng)新。
關(guān)于基因編輯工具的底層創(chuàng)新，其實(shí)國內(nèi)企業(yè)早就有所布局。近幾年，關(guān)于CRISPR/Cas12、CRISPR/Cas13基因編輯技術(shù)的相關(guān)成果頻頻爆出。在眾多的家族蛋白中，為何會(huì)是CRISPR/Cas12和CRISPR/Cas13率先“出圈”？其實(shí)這并沒有什么特定的原因。
這主要由于，相比于CRISPR/Cas9“密不透風(fēng)”的專利保護(hù)范圍，CRISPR/Cas12和CRISPR/Cas13具有巨大的專利布局空間。
從基因編輯工具本身來講，CRISPR/Cas12、CRISPR/Cas13與CRISPR/Cas9都使用了Cas家族蛋白，相關(guān)工具也都具有簡(jiǎn)便、高效的優(yōu)點(diǎn)（相比于ZFN、TALEN技術(shù)）。一些CRISPR/Cas12、CRISPR/Cas13系統(tǒng)相比于CRISPR/Cas9還具有尺寸更小便于AAV和質(zhì)粒遞送、PAM差異化序列、無需tracrRNA、編輯策略設(shè)計(jì)靈活等差異特性。
此外，CRISPR/Cas13基因編輯工具靶向RNA，提供了RNA水平的一種編輯手段，具有高度的靶向特異性，在非遺傳性疾病的藥物開發(fā)方面具有巨大的商業(yè)價(jià)值。這與CRISPR/Cas9和CRISPR/Cas12作用在DNA水平的成藥策略是不一樣的。CRISPR/Cas13其中的RNA敲降成藥策略方面與化學(xué)修飾小核酸的作用類似，后者是基于化學(xué)合成路線的原理。業(yè)內(nèi)人士認(rèn)為，CRISPR/Cas13RNA編輯工具的應(yīng)用，在未來也將會(huì)找到獨(dú)具優(yōu)勢(shì)的適應(yīng)癥或者應(yīng)用場(chǎng)景。
總體來說，Cas家族蛋白的真正應(yīng)用，一般需要挖掘發(fā)現(xiàn)和序列優(yōu)化：
首先，要在TB級(jí)的豐富數(shù)據(jù)庫中，通過AI、生物信息學(xué)、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)學(xué)等綜合分析，找尋潛在功能性蛋白。
其次，要在野生型的蛋白基礎(chǔ)上進(jìn)行各種序列的優(yōu)化，改造和修飾。對(duì)于已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的CRISPR/Cas9、CRISPR/Cas12、CRISPR/Cas13等家族，野生型蛋白都有一定的局限性，科學(xué)家也是對(duì)它們的序列進(jìn)行優(yōu)化和改造，來提高它們的編輯效率、PAM序列識(shí)別區(qū)域、特異性以及降低脫靶效應(yīng)、優(yōu)化編輯工具的大小等。
04 投資機(jī)構(gòu)還需被“教育”
底層技術(shù)和產(chǎn)品管線同等重要
通過上述篇幅，我們能夠看出基因編輯工具就像是細(xì)胞與基因治療行業(yè)的奠基石，只有不斷的開發(fā)和優(yōu)化基因編輯工具，細(xì)胞與基因治療產(chǎn)業(yè)才能走得更遠(yuǎn)。但是我們也能發(fā)現(xiàn)一個(gè)現(xiàn)象，國內(nèi)大部分企業(yè)針對(duì)基因編輯工具的開發(fā)和優(yōu)化都十分“低調(diào)”，從不宣傳。造成這一現(xiàn)象的原因有三：
首先，每家企業(yè)都有自己的形象定位和宣傳的偏向性。對(duì)于宣傳基因編輯工具，還是細(xì)胞與基因治療管線，企業(yè)選擇自由。
其次，大部分該領(lǐng)域的企業(yè)覆蓋到產(chǎn)業(yè)端時(shí)，大家可能更傾向于將顯性的藥品本身的里程碑進(jìn)展對(duì)外進(jìn)行宣傳，從而增強(qiáng)企業(yè)的品牌影響力和對(duì)投資人的吸引力。
再而，要想做到真正的底層創(chuàng)新，并不是一件易事。例如針對(duì)CRISPR/Cas12和CRISPR/Cas13的開發(fā)，目前一般都是先篩選野生型Cas12/Cas13蛋白，但野生型蛋白一般難以兼顧用作藥物治療時(shí)的安全性、有效性、免疫原性、脫靶等，而需要做一定的工程化改造。能做到這類工作的國內(nèi)企業(yè)少之又少。尤其是大部分初創(chuàng)企業(yè)，在資金和人才的雙重匱乏下，沒有進(jìn)行底層創(chuàng)新的實(shí)力和時(shí)間。大多數(shù)企業(yè)會(huì)選擇在推進(jìn)管線研發(fā)的過程中，順便做一些技術(shù)創(chuàng)新。
未來，新型的CAS蛋白或者是基于現(xiàn)有CAS蛋白的開發(fā)和優(yōu)化，大體會(huì)朝著活性更高、脫靶風(fēng)險(xiǎn)更小、PAM識(shí)別范圍更廣、尺寸更小、分子組合應(yīng)用創(chuàng)新等方向發(fā)展。
另一方面，在歐美生物醫(yī)藥行業(yè)，初創(chuàng)企業(yè)可以輕松憑借一個(gè)新的蛋白或一項(xiàng)新的技術(shù)，得到投資人的認(rèn)可，從而獲得不菲的融資。從國內(nèi)投資現(xiàn)狀來講，大部分投資人則更看重藥物本身的進(jìn)展。在這一點(diǎn)上，國內(nèi)的投資人還需要被持續(xù)教育：底層技術(shù)是公司未來發(fā)展的基石。
隨著行業(yè)的不斷向前，投資人們也在不斷接受新知識(shí)的洗禮。越來越多的在關(guān)注產(chǎn)品時(shí)，也會(huì)特別關(guān)注一些具有真正含金量技術(shù)的藥物研發(fā)企業(yè)。雖然不同的投資人判斷產(chǎn)品和技術(shù)的權(quán)重比例不同，但是這兩者之間本身就是相輔相成的關(guān)系。產(chǎn)品是成功技術(shù)的體現(xiàn)和放大，技術(shù)是產(chǎn)品研發(fā)的根基和后盾。